Cloning(2) 고찰

 

Cloning(2) 고찰

전반적인 흐름은 Cloning 3주 차까지 ligation 해서 만든 Plasmid를 competent cell에 넣어주고 항생제 처리가 된 LB 배지에 배양한다. 우리가 원하는 Plasmid는 항생제를 억제하고 colony를 형성하게 된다. colony로부터 우리가 원하는 Plasmid가 존재하는지 알아보기 위해 Colony PCR을 진행하고 전기영동을 해줌으로써 염기서열을 확인할 수 있게끔 만들어준다.

 

형질전환을 하기 전에 DNA를 넣어줄 competent cell과 그 cell이 항생제로부터 이겨내어 colony를 형성할 수 있게 해 줄 LB 배지를 만들어 주어야 한다.

 

LB plate 만들기

 

Ligation 한 Plasmid DNA를 넣어줄 예정인 c.p cell(reco)과 일반적인 c.p cell(con)을 따로 LB 배지에 넣어주어야 하므로 총 2개를 만들었다. LB 배지를 만들 때 주의해야 할 점은 고압에서 멸균시킨 후 바로 항생제를 넣어주면 안 된다. 뜨거운 상태에서 항생제를 넣으면 제 역할을 하지 못할 수 있기 때문이다. 또한 LB 배지를 만들 때 Dish에 붓는 과정에서 빠르게 흔들어주지 않으면 굳어져 버릴 수 있으며 오염되지 않도록 조심해주어야 한다.

 

Competent cell 만들기

 

Competent cell을 만들기 위해 DH5 a를 사용하였는데 OD600 값을 측정하였을 때 0.4~0.6 정도가 될 때까지 키워 주어야 한다. 그 이유는 DNA를 받아들이는 능력을 갖추는 좋은 조건인데 OD600이 0.4-0.6일 때가 competency가 최대가 되기 때문이다. 이때 CaCl2를 처리해 주어 형질전환의 효율을 최고로 높일 수 있다. 또한 Glycerol을 넣어 주는데 이는 competent cell을 보호하는 일종의 보호 버퍼 역할을 한다. Glycerol이 없이 낮은 온도에 보관하다가 꺼내면 빨리 얼고, 녹기 때문에 피해를 볼 수 있기 때문이다.

 

Transformation

 

 

만들었던 competent cell을 Plasmid DNA와 섞어주고 heat shock이라는 형질 전환법을 사용한다. 서론에서 한 설명과 같이 CaCl2가 이어주는 역할을 하며 낮은 온도는 전하의 분포를 안정하게 해준다. 형질 전환이 완료되면 LB plate에 spreading을 해준다. 이 과정에서 주의해야 할 점은 LB plate가 오염이 되지 않도록 뚜껑을 최대한 적게 열고 알코올램프 가까이 가서 spreading을 해주어야 하며 LB plate가 찢어지지 않을 정도의 세기로 어느 정도 배지에 흡수되어 흐르지 않을 때까지 spreading을 해주어야 한다.

 

일주일 후, Recombination(reco)에서만 colony가 발견되어야 실험에서 좋은 결과를 얻는 것인데 control에서도 colony가 발생하였다. 그 이유는 정상적으로 항생제에 저항성이 없는 세포가 배양되었다는 것인데, Kanamycin 항생제가 제 역할을 하지 못한 것이라 추측할 수 있다. Colony PCR 이번 실험에서 사용한 Colony PCR은 ligation 잘 되었는지 확인하는 방법 중 하나로서 Colony PCR은 시간이나 경제적인 면에서 유리하다. Colony 2개를 선택하여 D.W에 섞고 95C에 10분간 끓이는데 이는 cell을 파괴하고 Centrifuge를 통해 상층액에 Plasmid가 존재하게끔 만든다. 상층액과 PCR premix를 섞어 PCR을 해주면 된다.

 

Colony를 tip으로 딸 때 독립적으로 멀리 떨어져 있는 colony를 선택하는 것이 좋다. 항생제를 이겨낸 독립적인 colony이기 때문에 우리가 원하는 Plasmid가 있을 확률이 높다. 또한 큰 colony 하나의 주변에 많고 조그마한 colony 위성이 있을 수도 있는데 주변 colony는 우리가 원하는 Plasmid가 아닐 가능성이 높다. 큰 colony가 주변 영양분과 항생제를 빨아들이면서 주변에 colony가 잘 자랄 수 있을 확률이 높다. 그러므로 우리가 원하는 Plasmid가 아닐 가능성이 높다. Colony는 군집으로, 그 안에 존재하는 cell은 모두 동일하다. 그러므로 만약 우리가 원하는 Plasmid DNA라면 colony를 재사용할 수도 있기 때문에 어떤 colony를 땋는지 기억하기 위해 colony marking을 꼭 해줘야 한다. 또한 명심해야 할 것은 tip을 이용하여 딸 때 colony의 일부만을 따야 하며 전부 다 따버리면 의미가 없어진다는 것이다. 만약 딴 colony가 우리가 원하는 Plasmid를 가지고 있다면 그 colony를 다시 재사용해야 하는데 colony를 다 따버린다면 재사용할 수가 없다. 그러므로 딸 때 일부만을 따야 한다. 일부를 또 써야 하기 때문에 colony를 살짝만 건드려서 따도 괜찮다.

 

 

Colony PCR을 통해 insert 부분이 다량으로 복제가 되고 그것을 가지고 전기영동을 하여 얻은 band의 염기서열을 분석해보고 우리가 원하는 Plasmid가 맞는지 확인해야 한다. 전기영동 결과, ladder의 1000bp 부분에서 band가 확인이 되어야 하는데 확인되지 않고 500bp보다도 낮은 값으로 band가 나왔다. band가 500bp보다 낮게 나타난 것을 보면 PCR을 통해 복제가 일어나지 않았으며 Primer들끼리 붙는다든지, Primer 들만 이 band에 나타나게 된 것이다. 500bp보다 낮은 band가 나온 것은 6조뿐만 아니라 다른 조들도 마찬가지였으며 선택한 colony에 원하는 Plasmid가 없었다는 것을 알 수 있었다.

 

insert 자체가 복제되지 않았다는 것은 colony 2개만을 선택해서 운이 좋지 않게 재조합 Plasmid가 없었을 수도 있지만 2개를 제외한 나머지 colony를 PCR을 해보아도 똑같은 결과가 나올 수도 있다. 일단 control plate에서도 colony가 관찰됐기 때문에 우리가 원하는 재조합 Plasmid를 얻을 확률이 아주 낮았고 제한 효소 처리를 한 insert와 vector의 band는 전기영동을 통해 적절한 band를 갖는 것을 확인했기 때문에 그다음 실험과정인 ligation 자체가 안 됐을 확률이 높다. 또한 DNA의 순도가 아주 중요한데 실험을 통해 순도가 좋지 않은 값을 보였다. 정제 과정 중 salt나 alcohol 등에 의해 오염될 경우, ligation 반응이 저해되었을 수도 있다.

 

Colony PCR의 방법 말고 ligation이 잘 되었는지 확인하는 다른 방법으로는 Cracking method가 있다. 이 방법에서는 약 20개의 colony를 사용하는데 그 과정은 Trans formant(형질전환 일으킨 것)를 배양해서 배양액을 조금 덜어 tube에 담은 뒤, phenol/chloroform + loading buffer dye가 들어있는 cracking solution을 섞어 vortexing하여 cell을 파쇄한다. 이를 원심분리하여 DNA가 포함된 분획을 ago rose gel에 로딩하면 된다. 전기영동을 통해 genomic DNA, plasmid DNA, rRNA 순으로 bands가 보이게 된다.

 

또한 2개의 그룹으로 나누어 확인할 수도 있는데 그 과정은 Ligation의 확인 여부를 위해 self(insert가 들어가지 않고 vector의 sticky end가 붙어서 형성된 것)와 Ligation 2 group을 만들고 D.W, T4 Ligase buffer, vector, insert, Ligase를 섞은 후 R.T에서 2 hr~4 hr 방치한다. Ligation reaction이 끝나면 Transformation을 실시하여 Plate 상에서 확인하고 만일 self plate에도 colony가 많이 형성되면 efficiency가 낮은 것으로 간주하고 사용하지 않는 방법이 있다. 이외에도 또 다른 방법들이 존재한다.