RNA isolation 고찰

 

Trizol RNA Extraction

 

 

cell이 dish에 깔려있었는데 media 배지를 제거하고 1 ml trizol로 cell을 떼어내어 e-tube에 옮겨 담았다. 그 이후에 200 chloroform을 넣어주었다. 원심분리를 해주면 organic phase, interphase, aqueous phase로 3개의 층으로 분리되었음을 확인하였다. 그중 상층액만 따서 isopropanol과 새로운 e-tube에 섞고 원심분리를 하면 RNA pellet이 보이게 된다. 상층액을 제거하고 pellet에 ethanol을 넣어 pellet을 풀어주고 vortex 후 원심분리를 하게 되면 또다시 pellet이 생성된다. ethanol을 증발시키기 위해 e-tube를 뒤집어 놓아 air dry 시키고 30 DEPC water를 넣고 pellet을 풀어주는 것으로 실험을 마무리하였다.

 

Agarose gel loading & RNA 확인

 

지난 실험에서 추출한 RNA sample을 이용하여 Agarose gel loading & RNA 확인과 RNA 순도를 측정해보았다. 전기영동을 통해 형광 band를 보기 위해 safe view를 사용하였다. (ETBR을 섞어서 RNA 사이에 들어가서 형광을 띄어야 하지만 유해하므로 대체) 먼저 새 e-tube에 10x loading buffer와 RNA sample을 넣어주고 Pipette로 잘 섞어준다.

 

이때 주의해야 할 점은 sample이 (+)극으로 이동해야 하기 때문에 home은 (-)극을 띄는 부분에 위치하게 하고 loading을 해준다. loading을 마무리했으면 130V로 1시간 걸어준다.

 

그 후에 UV를 쫴서 band를 확인하면 된다. UV를 쬔 결과 ladder의 band는 흐릿하게 나오긴 했지만 4번째에 위치한 6조의 sample에서는 band를 보이지 않고 연속적인 형광을 보였다.

 

RNA 순도 측정

그다음으로는 남은 RNA sample을 이용하여 RNA 순도 측정을 해보았다.

 

DEPC water와 RNA sample을 새로운 e-tube에 넣고 pipette로 잘 섞어주고 총 양을 따서 cuvette에 넣고 Spectrophotometer로 양을 측정해보았다. A260/A280은 1.424로 pure(1.9~2.0) 하지 않는 값이 나왔고, A260/A230은 1.787 값으로 pure(2.0~2.2) 하지 않는 값이 나왔다. 화면에서 나타나는 그래프는 측정한 RNA의 흡광도 측정값을 나타낸다.

 

 

고찰

 

두 번째 실험인 RNA isolation을 위해 10월 18일에 Trizol RNA Extraction, 11월 1일에 Agarose gel loading & RNA 확인 실험을 진행하였다.

 

Trizol RNA Extraction

 

dish에 깔린 media 배치를 제거하고 trizol로 cell을 떼어 냈다.

 

여기서 trizol은 guanidinium thiocyanate와 acid phenol로 구성이 되어있는데 세포의 세포막 단백질과 다른 단백질들, DNA를 변성시키고 RNase 효소들을 억제하여 침전시키는 역할을 한다. 이에 따라 RNA가 노출될 수 있도록 도와준다. RNA는 변성이 되지 않는데 DNA보다 산성에서 더 안정하기 때문에 유기용매에 녹지 않고 수층으로 이동하게 된다. 그 후에 chloroform을 넣어주면 3개의 층으로 나누어지게 된다. chloroform은 세포막의 지질을 녹이기도 하며 수층에 있는 phenol 성분을 없애기 위해 사용이 된다. phenol은 물에 최대 5%까지 녹을 수 있기 때문에 일부가 수층에 존재하는데, phenol을 없애는 원리는 phenol은 물보단 비극성 용매인 chloroform에 가는 경향이 있어 수층으로부터 phenol을 제거하고 trizol층으로 이동하게 된다. 이러한 과정을 통해 RNA는 aqueous phase에 존재하게 되고 interphase에는 DNA, organic phase에는 proteins, lipids 등이 존재하게 된다.

 

3개의 층 중에서 상층액 부분만을 따 새로운 e-tube에 넣고 isopropanol을 넣어주고 원심분리를 시켜주었다. e-tube 내에서 RNA pellet이 있게 되고 상층액을 제거하고 75%의 ethanol을 넣어주어 pellet을 풀어주고 원심분리를 해준다. isopropanol과 ethanol은 RNA와 염을 용해하는 유사한 역할을 하지만 넣어주는 순서가 중요하며 어떠한 원리로 인해 RNA만 남게 되는지 알아야 한다. RNA, DNA, salt에 대한 용해도가 isopropanol보다 ethanol이 더 강하다. 용해도가 강하다는 뜻은 더 잘 녹고 침전을 덜 시킨다는 것으로 ethanol보다 isopropanol이 더 침전을 잘 시킨다는 것으로 해석할 수 있다. 많은 RNA pellet을 얻기 위해선 isopropanol이 더 효과적 일 수밖에 없으며 상층액과 섞은 후 원심분리를 하게 되면 pellet에 많은 양의 RNA와 염이 존재하게 된다. 원하는 것은 RNA pellet이기 때문에 염을 제거해줘야만 한다. 그러므로 그다음 ethanol을 섞어주는 것이다. ethanol의 농도가 중요한데, 염을 많이 용해하고 RNA를 침전시켜야 하기 때문에 최적의 농도인 75%의 ethanol을 사용하는 것이다. 원심분리한 후, 염은 ethanol에 녹아들게 되어 RNA pellet이 만들어지게 된다. 원심분리를 하기 전 몇 분간 상온에서 incubation을 하는 과정이 있는데 이는 충분히 침전이 일어날 시간을 주기 위한 것이고 이 과정을 생략한다면 pellet이 잘 보이지 않을 수 있으니 꼭 거쳐야 하는 과정이다.

 

air dry를 통해 ethanol을 완전히 증발시켜주고 DEPC water를 넣고 pellet을 풀어준다. ethanol을 되도록 꼭 없애줘야 하는데 만약 ethanol이 남아있게 된다면 전기영동 과정 중 home에 sample을 load ng 할 때 sample이 확산할 위험이 있기 때문이다. DEPC water를 넣어주는 이유는 RNase를 비활성화시켜 RNA가 분해됨을 막기 위해서이다. 이 실험을 통해 RNA sample을 만들었으며 Agarose gel loading과 순도 측정에 사용되었다.

 

Agarose gel loading & RNA 확인

 

전기영동을 하기 전에 RNA sample과 10x loading buffer를 e-tube에 넣고 섞어 주었다. loading buffer에는 glycerol, sucrose, fico ll 등 분자량이 큰 물질들이 들어 있는데 이는 점성이 높아 시료의 무게를 무겁게 하여 home에서 sample 들이 확산하지 않고 가라앉도록 해주는 역할을 한다. 또한 loading buffer에는 bromophenol과 xylene cyanol이 들어있기 때문에 전기영동을 하는 동안 밴드가 얼마만큼 이동했는지 알 수 있도록 하는 가시적인 효과를 주기도 한다.

 

※ 10x, 6x loading buffer

 

6x, 10x는 얼마나 농축이 되었는지 말해주는데 보통 1x로 만들어서 사용한다. 6x의 경우 1:5의 비율로 증류수와 섞어 1x를 만들고 10x의 경우 1:9의 비율로 증류수와 섞어 1x를 만들 수 있다.

 

섞은 sample을 loading 하기 전 gel의 well 방향은 전기영동을 하는데 꼭 체크해야 할 요소 중 하나이다. RNA는 음전하를 띄고 있기 때문에 (-)전하에서 (+)전하로 이동해야만 한다. 전기영동의 시작은 home에서부터 시작하므로 home은 (-)전하에 위치해 있어야 한다. 그러므로 (-)전하를 나타내는 검은 색 전선을 home 쪽 방향에 연결하고 반대 방향에 (+)전하를 나타내는 빨간 색 전선을 연결해야지만 정상적인 전기영동이 진행될 것이다.

 

전기영동을 한 지 1시간이 지나고 UV를 쫴서 band를 확인해보았는데 보통 실험 결과 두 개의 28S, 18S 진한 band가 보여야 하지만 band를 찾아보기 어려웠고 연속적인 형광만 보였다. 이는 smearing 현상 때문인데 전기영동 끌림 현상이라는 것이다. 여러 종류의 작은 RNA 들이 질질 끌려 이동하게 되면 연속적인 형광을 보이는 것이다.

 

결과 사진을 보면 ladder는 어느 정도 band가 보이기 때문에 gel에는 이상이 없음을 알 수 있다. 그러므로 원인은 sample과 buffer에서 찾아볼 수 있다. 먼저 sample이 오염된 것일 수 있는데 Trizol RNA Extraction 실험에서 RNA가 속해 있는 Aqueous phase를 따는 과정 중에 interphase까지 뽑게 되면 DNA 또한 포함되어 있기 때문에 선명하게 band가 보이지 않았을 것이라 추측할 수 있다. 두 번째로는 전기영동을 하는 과정에서 전압을 120V~130V로 높게 걸어주었기 때문에 질질 끌리는 smearing 현상이 일어난 것으로 생각할 수도 있을 것이다.

 

마지막 원인으로는 염색 dye가 많이 들어가 background 자체가 진하게 나온 것이라 예상할 수 있다.