RNA isolation

 

RNA isolation

 

이 실험에서는 RNA를 세포에서 분리하는 것이 목적이다. Trizol은 RNA나 DNA를 분리할 때 쓰는 시약이며, Chloroform을 첨가하면 3개의 층으로 나누어진다. 가장 밑층에는 단백질, 중간층에는 DNA가 존재하며 가장 상층에는 RNA가 존재한다. 상층을 pipette를 이용하여 분리할 때 중간층을 건들지 않도록 주의가 필요하다. 앞에서 언급한 바와 같이 RNA는 2‘-hydroxyl group이 존재하며 이에 따라 RNase로 인하여 쉽게 파괴된다. RNase는 다양한 RNA를 파괴할 수 있으며 RNase는 거의 모든 세포에 존재하며 피부 표면에도 존재한다. 그러므로 대부분의 실험실 기구에는 RNase로 오염되어 있으며 RNase를 효과적으로 제거할 수 있는 방법은 없으므로 실험하는 동안 장갑을 껴야 하며 대화도 자제하도록 해야 한다

 

Trizol

Trizol은 RNA/DNA/protein 추출 방법으로 정확한 이름으로는 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction이라고 부른다. guanidinium thiocyanate와 phenol은 세포막 단백질이나 다른 단백질들을 변성시키고 DNA와 RNase 효소들을 억제하여 침전시키는 역할을 한다. 이러한 역할들을 통해 RNA가 노출될 수 있게끔 도와준다.

 

RNA band

 

Total RNA는 rRNA, mRNA, tRNA를 함유하고 있는데 80%가 rRNA로, 28S, 18S, 5S subunit으로 이루어져 있다. 이 중 28S와 18S는 5S보다 많은 양을 차지하고 tRNA는 15~20%, mRNA는 5%를 차지한다. 그러므로 RNA 중에서 가장 많은 양을 차지하는 rRNA가, 그중에서도 많은 양을 차지하는 18S와 28S의 밴드가 가장 진하게 나타나는 것이다. 가끔 전기영동 결과 18S와 28S의 밴드 사이에 smear 되는 형태가 나타나는 경우가 있는데, 이것은 잡다한 RNA 종류가 매우 적은 양이어서 smearing 된 것이다.

 

DEPC water

 

DEPC (Diethyl Pyrocarbonate)는 단백질의 Histidine, Tyrosine residue에 modification을 일으키는 물질이다. 그리고 RNase를 inactivation 시키는 것으로 알려져 있으며, 대개 용액 내에서 0.1% 농도로 사용한다. RNA 분리 및 관련 실험에는 DEPC가 처리된 시약을 사용하게 되어 있으며, 이것은 발암물질로 추정되므로 다루는 과정에서 항상 조심하도록 해야 한다.

 

Isopropanol과 Ethanol DNA

 

RNA 용해도에 있어서 Ethanol이 isopropanol보다 더 강하기 때문에 isopropanol을 사용할 경우보다 적은 양으로 효과적으로 침전시킬 수 있다. salt 용해도에서도 Ethanol이 isopropanol보다 더 강하기 때문에 salt가 DNA or RNA와 함께 침전되는 경향이 강하다. 보통 isopropanol로 DNA or RNA 침전을 시키면 pellet의 크기가 커지는데, 이는 isopropanol이 DNA or RNA를 보다 효율적으로 침전시키는 이유도 있지만 salt가 같이 침전되기 때문이다. 침전단계에서 salt도 더 많이 같이 침전되기 때문에 제거하여야 하고 휘발성이 낮은 isopropanol도 남김없이 제거하여야 한다. 그래서 isopropanol보다 salt 용해도와 휘발성이 높은 Ethanol을 70~75%로 사용하여 DNA or RNA pellet을 씻어주면, DNA or RNA는 침전상태로 남겨두고 침전된 salt는 녹여 제거할 수 있으며 Air-Dry만으로 쉽게 남은 용매를 제거할 수 있다. 이러한 이유로 DNA or RNA 침전 시 isopropanol 침전과 Ethanol wash 과정으로 나누어져 있다.

 

핵산의 농도 측정

 

핵산의 푸린과 피리미딘 염기는 그들이 가지는 방향족 구조로 인해 자외선을 흡수하는 성질을 가진다. pH 7에서 이러한 흡수성은 260nm에서 최댓값을 보인다. 따라서 DNA와 RNA 등 핵산 수용액의 농도 측정을 위해서는 분광광도계를 이용하여 260NM에서의 흡수고를 측정한다. 핵산의 순도, 특히 RNA의 순도를 측정하기 위해서 보통 260 NM에서의 흡광도뿐만 아니라 280 NM에서의 흡광도를 동시에 측정하여 OD의 비율을 계산한다. 280nm에서 측정하는 이유는 단백질에 포함된 방향 고리 구조를 가지는 타이로신과 트립토판 같은 아미노산이 280nm에서 최대 흡수고를 보이기 때문에 이 비율을 계산하여 분리된 RNA 용액이 어느 정도의 단백질을 함유라고 있는지를 알 수 있다. 또한 RNA의 경우 OD의 비율 이외에도 OD 260/230의 비율도 계산한다. 230nm에서는 페놀과 같은 용매, 염과 단백질 등이 높은 흡광도를 보이므로 이러한 물지의 오염 여부를 알 수 있다. 따라서 순수하게 분리된 RNA의 OD 260/280 값은 1.8-2.0을 가지며, OD 260/230 값은 1.8 이상의 값을 가진다. 즉, OD의 값이 1.8 이하이면 분리된 RNA는 추출 과정 중 사용한 시약 중 페놀, thiocyanate guanidine, 알코올과 기타 유기 용매에 의해 오염되었음을 말해준다.

 

이 실험에서는 RNA를 세포에서 분리하는 것이 목적이다.

 

Trizol은 RNA나 DNA를 분리할 때 쓰는 시약이며, Chloroform을 첨가하면 3개의 층으로 나누어진다. 가장 밑층에는 단백질, 중간층에는 DNA가 존재하며 가장 상층에는 RNA가 존재한다. 상층을 pipette를 이용하여 분리할 때 중간층을 건들지 않도록 주의가 필요하다. 앞에서 언급한 바와 같이 RNA는 2‘-hydroxyl group이 존재하며 이에 따라 RNase로 인하여 쉽게 파괴된다. RNase는 다양한 RNA를 파괴할 수 있으며 RNase는 거의 모든 세포에 존재하며 피부 표면에도 존재한다.

 

그러므로 대부분의 실험실 기구에는 RNase로 오염되어 있으며 RNase를 효과적으로 제거할 수 있는 방법은 없으므로 실험하는 동안 장갑을 껴야 하며 대화도 자제하도록 해야 한다.